糖化应激标志物的检测方法(1) 血糖、糖化蛋白、糖化反应中间体的检测

糖化应激标志物的检测方法(1)　血糖、糖化蛋白、糖化反应中间体的检测

同志社大学大学院生命医科学研究科糖化应激研究中心
八木雅之教授主编

高血糖、羰基化合物的产生和蓄积，导致糖化应激亢进。紫外线和氧化会加速这一系列反应。抗糖化不应仅应对狭义的糖化反应，还需要应对广义概念的抗糖化应激。体内的葡萄糖和蛋白质的非酶反应过程中产生的各种物质为评价糖化应激的标志物。

本文将介绍关于血糖、HbA1c、糖化白蛋白、糖化反应中间体的检测方法。

血糖的检测

从评价餐后高血糖状态的观点来看，血糖（葡萄糖）是糖化应激的标志物。检测血糖值最简单的方法是血糖自我检测（self-monitoring of blood glucose；SMBG）。血糖的检测原理包括酶电极法和酶比色（比色定量）法⁽¹^）。

根据所用葡萄糖分解酶的不同，酶电极法可分为葡萄糖氧化酶（glucose oxidase；GOD）法和葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase；GDH）法⁽²^）。这两种方法均是将酶分解血中葡萄糖时产生的电子传递给电子载体（介体）六氰合铁络合离子（ferricyanide ion），转换为六氰合亚铁络合离子（ferrocyanide ion）（图1）。之后，由于向电极施加恒定电压时产生的电流与血糖浓度对应，因此检测出的电流量即为葡萄糖浓度。

图１　酶电极法的葡萄糖传感器反应流程图2
GOD：glucose oxidase，GDH：glucose dehydrogenase

酶比色（比色定量）法包含己糖激酶（hexokinase；HX）法和葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOD / POD）法。HX法是将血糖转变为葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate；G6P）后，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PDH）作用下生成NADH和四唑，使黄递酶作用于这些物质，对显蓝色~红色等的甲瓒（formazan）进行比色定量。GOD / POD法，是指在 GOD 作用下由血糖量生成过氧化氢，其在 POD（peroxidase）的作用下与发色团进行反应，生成醌类色素，对醌类色素进行比色定量。

SMBG 时，如果血细胞比容值接近参考范围（20～60％），则可以准确检测血糖。但是，诸如贫血患者和透析患者在血液水平低于 20% 时呈高值，新生儿和月经前女性等因超过 55% 的多血症血时呈低值。此外，对于 GOD 法，血液中的溶解氧分压越大，检测的血糖水平越低⁽³^）。

日本已有多家生产商出售具有多种特征的 SMBG 仪，可以根据用途进行选择⁽⁴^）。检测时间因仪器而异，通常约为 5～30 秒。需说明的是，在日本，根据药品注册法，SMBG 被归类为高度受控医疗器械（Ⅲ类），因此广告宣传受限。

HbA1c、糖化白蛋白的检测

糖化反应分为前期反应、中间体生成和后期反应。前期反应中生成的 Amadori 化合物包括 HbA1c 和糖化白蛋白（glycoalbumin；GA）等糖化蛋白。这些化合物作为反映过去血糖状态的指标用于糖尿病的评估，与血糖值一样，是一种有效的糖化应激标志物⁽⁵^）。

HbA1c 是一种通过缬氨酸（血红蛋白 A 的β链N末端的氨基酸）与葡萄糖的糖化反应，经席夫碱形成的酮胺化合物（糖化蛋白）。由于糖化反应取决于血糖浓度，因此产物 HbA1c 随高血糖程度（浓度、时间等）的增高而增加。由于生成的 HbA1c 持续存在 120 天（即红细胞的寿命），因此血中总血红蛋白（血红蛋白A）所含 HbA1c 的比例（％）能反映过去 1～2 个月内的血糖状态。

HbA1c 的检测方法包含 HPLC 法、免疫法和酶法⁽⁶^）。 HPLC 法采用离子交换色谱法分离和分析血红蛋白，并根据 HbA1c 和总血红蛋白的峰面积计算 HbA1c 值。 HPLC 法的优点在于除 HbA1c 外，还可以检测 HbF（胎儿血红蛋白）和异常血红蛋白等。免疫法是使用以 HbA1c 为抗原制备的抗体进行检测的一种方法，可以选择性地仅检测 HbA1c。由于使用的是高度特异性抗体，因此除 HbA1c 外，不易受其他血红蛋白的影响。酶法是通过蛋白水解酶释放血红蛋白β链N末端的糖化二肽，然后利用具有果糖基肽氧化酶的比色系统进行检测。酶法适合使用自动分析仪进行大量样本处理。但是，免疫法和酶法需要另行检测总血红蛋白量，以计算 HbA1c 值。此外，HbA1c 检测值已进行国际标准化，并已引入 NGSP（National Glycohemoglobin Standardization Program；国际标准）值⁽⁷^）。因此，与 NGSP 值相比，日本国内日常医疗一直以来使用的 JDS（Japan Diabetes Society：日本糖尿病学会）值需要向上校正约0.4％。

GA 是血清白蛋白的糖化蛋白。白蛋白的半衰期约为 20 天，因此能反映过去 2 周～1 个月内的平均血糖水平。因此，GA 还可以适用于血糖值波动较大的糖尿病患者和正在接受药物治疗（胰岛素给药等）的患者。此外，在白蛋白分子内发现了 4 个糖基化位点（Lys-199、281、439、525)⁽⁸^），与 HbA1c 相比，其特点是对血糖水平的波动作出相对较快较大的响应和转变。

GA 的检测方法有 HPLC 法和酶法。但是，目前在临床检查中使用的检测方法主要是酶法。酶法是通过蛋白水解酶分解血中的白蛋白释放糖化赖氨酸，然后利用具有酮胺氧化酶的比色系统进行检测。此外，另行采用溴甲酚紫（bromocresol purple；BCP）法特异性地检测血白蛋白，计算血白蛋白所含GA的比例（％）。

HbA1c 和糖化白蛋白同时也是生活习惯病筛查和献血等时血液检查的检测项目之一，可以在临床检查合同机构等进行检测。

糖化反应中间体

血中的糖化反应中间体包括 3DG（3-deoxyglucosone）、乙二醛（glyoxal；GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal；MG）、甘油醛（glyceraldehyde）和乙醇醛（glycolaldehyde）等（图2）⁽⁹^）。

图2　糖化反应路线图
改自Takeuchi M, et al.⁽⁸⁾

3DG是由Amadori化合物生成的α-二羰基化合物，其反应活性比葡萄糖高 10,000 倍，并参与 AGEs 的形成。血浆中 3DG 浓度每升高 100 nmol/L，糖尿病性视网膜病变、肾病的风险增加约 2 倍（图3）^(10）

图３　糖尿病患者的血3DG浓度和肾病、视网膜病变的进展程度⁽¹⁰⁾Benferroni / Dunn 多重比较检验

GO 在葡萄糖的自氧化和脂质过氧化过程中产生。 MG 也可在细胞内经糖酵解系统和多元醇途径产生。糖化反应中间体因各化合物的糖化反应途径不同，其最终生成的 AGEs 的类型也不同。特别是以甘油醛为中间体的 AGEs 被称为 toxic-AGEs（TAGE），与糖尿病并发症的发病进展密切相关⁽¹¹^）。

可以采用预标记 HPLC 法研究性地检测 3DG、GO、MG ⁽¹²^）。在对血液样本除蛋白后，添加 2,3-diaminonaphthalene（DAN），将糖化反应中间体进行氨基萘衍生化并纯化，然后采用反相 HPLC 检测以上物质。紫外光（波长 268 nm）或荧光（激发波长 271 nm、发射波长 503 nm）可用于检测氨基萘化的糖化反应中间体。

References

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糖化应激和抗衰老

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