糖化应激和抗衰老

糖化应激标志物的检测方法(2)　AGEs的检测

同志社大学大学院 生命医科学研究科 糖化应激研究中心
八木雅之 教授 主编

体内的葡萄糖和蛋白质的非酶反应过程中产生的各种物质为评价糖化应激的标志物。本文将介绍AGEs的检测方法和无创检测生物体内AGEs的方法。

AGEs的检测

在后期反应中生成的血中 AGEs 包含羧甲基赖氨酸(N^ε-carboxymethyl lysine ; CML)⁽¹⁾、戊糖素(pentosidine)⁽²⁾、羧甲基精氨酸(N^ω-carboxymethylarginine;CMA)⁽³⁾等各种物质。

CML 是由赖氨酸以 GO(glyoxal)为中间体产生的一种非荧光性、非交联性AGEs，在糖尿病和氧化应激加剧时也会产生。如果将已形成CML的胶原蛋白添加到人皮肤成纤维细胞的培养基中，可促进细胞凋亡⁽⁴⁾。在皮肤中，它也存在于代谢周转相对较快的表皮层⁽⁵⁾。角质层中的CML蓄积与皮肤肌理的丧失有关⁽⁶⁾。

戊糖素是一种由核糖、精氨酸、赖氨酸高效生成的荧光性、交联性AGEs，作为肾病的早期临床标志物之一，在日本可使用医保。近年来，血液和尿液中的戊糖素作为反映骨质老化的标志物备受关注，并有望用于骨质疏松症的诊断⁽⁷⁾。此外，戊糖素还存在于皮肤胶原蛋白中，并随年龄增加而增多。糖尿病患者皮肤中的戊糖素蓄积量高于同年龄健康人⁽⁸⁾。

CMA 是一种由精氨酸以 GO 为中间体产生的AGEs，特异性地存在于胶原蛋白中⁽³⁾。

ELISA试剂盒已有多家公司在售，可用于检测血中CML和戊糖素^(9-10)。但是，检测生物样品中的 AGEs 时，需要进行与待测糖化反应产物的特性相符的处理。检测CML和戊糖素时，如果将血液样品在高温下进行加热处理，则会在样品预处理过程中人为产生 AGEs，导致检测值升高，产生误差⁽¹¹⁾。

检测戊糖素时，可采用HPLC法来避免检测值升高产生误差。在HPLC法中，对血清样品进行盐酸水解后，通过离子交换柱等预处理除去样品中的杂质，再利用反相HPLC分离和分析戊糖素(图１)⁽¹²⁾。检测戊糖素时，使用戊糖素的特异性荧光(激发波长 335 nm，发射波长 385 nm)。但是，HPLC法存在诸如预处理时的回收率降低、避免在待测峰中混入杂质及难以检测多个样品等的课题。

图１　用HPLC法检测血清戊糖素的色谱图⁽¹²⁾
色谱柱:Vydac 218TP54(250 x 4.6mm ID,5 µm)
洗脱液:0.1% HFBA / acetonitrile(82.5 / 17.5), 流速:1.0 mL/min,
温度:30℃,检测出：荧光(ex 330 nm / em 375 nm)

利用AGE Reader^®无创检测皮肤中的AGEs

皮肤中的AGEs蓄积被认为是皮肤紧致度和弹性降低等皮肤老化的因素之一。可以利用AGE Reader(DiagnOptics公司制)检测皮肤的荧光强度(auto fluorescence; AF)，由此无创检测皮肤的荧光性AGEs蓄积量^(13-14)。

AGE Reader 是为评价糖尿病并发症进展风险而研发的一种无创检测皮肤中AGEs蓄积量的临床检验仪器^(15-17)。当皮肤受到紫外线照射时，蓄积在组织内的荧光性AGEs 被激发并发出特有的自发荧光，本仪器正是利用这一性质检测AGEs(图2)。

图2　AGE Reader^®的检测系统和主机结构模式图
A : 手臂(检测部位)，B : 光源(Black light)，C : 玻璃纤维，D : 分光镜

在AGE Reader 的检测系统中，将由设置在盒形(280(长)×150(宽)×115(高)mm)主机内的光源(UV-A black-light)发出345～410 nm(最大波长365 nm)波长的光，通过约2×2 cm 的玻璃窗作为激发光照射到皮肤表面。本仪器将激发光经皮肤发出的 420～600 nm 的荧光通过玻璃纤维引入分光镜，利用专业软件分析所得信息后，计算 AF⁽¹⁸⁾。检测时间约为90秒(3次检测模式的情况下)。AGE Reader 还可以在检测荧光的同时，检测白色LED光的皮肤反射光(reflection ; Ref)，并在Ref低于12％时校正检测值。但是，在Ref低于6％时无法检测。因此，无法检测肤色为深棕色、肤色较黑的受试者(Fitzpatrick class 5-6 skin color)。另外，检测值会受使用含防晒霜等在内的护肤化妆品等的影响，因此检测前需彻底清洗检测部位。

皮肤AF可根据荧光(420～600 nm)强度占激发光(300～420 nm)的比例计算出来，并可用任意单位(arbitrary units;AU)表示。由AGE Reader计算出来的 AF 将综合考虑受试者的性别、年龄等，与生产商所积累数据的比较图表一同输出。但是，生产商尚未公开AF的分析公式。

使用AGE Reader检测的AF值显示了肤色白的人群(Fitzpatrick class 1-3 skin color)中在糖尿病患者和健康人里与年龄增长的关系。检测值随年龄增长和糖尿病而升高。

生产商建议的皮肤AGEs检测部位是前臂。检测时，前臂的检测对受试者的动作负担较小，但不同季节明显影响受试者受紫外线照射的程度。以肤色白的人群为对象进行检测部位比较的结果显示，前臂和下肢与糖尿病并发症密切相关⁽¹⁹⁾。

另一方面，日本人的皮肤暴露在紫外线下时会变红，肤色会变深。因此，在检测日本人时，对不易受紫外线影响的皮肤测量检查中推荐的上臂内侧(对距右臂肘端约10cm部位)可以稳定检测(图３)^(20-21)。使用AGE Reader的皮肤AGEs检测部位需根据紫外线的影响、肤色、待测人种适当选择。

图3 使用AGE Reader ®检测上臂内侧
红色箭头表示检测部位

采用胶带粘贴法检测角质层CML

角质层位于皮肤最外层，由角质细胞和细胞间质组成。角质层因表皮层不断产生的角质细胞和从表面的剥脱而不断重建，维持机体防御功能，如保湿、屏障功能等。另一方面，有关年龄增长引起皮肤变化的研究多是从组织学的角度进行的，能从生化角度进行简单检测的方法较少。

众所周知，胶带粘贴法使用胶带剥离采集角质层细胞，是一种能无创评价角质层功能的方法。在胶带粘贴法中，报告了脱落角质细胞数、角质细胞面积、细胞形态和细胞核存活率检测等形态学的评价方法。

另一方面，还报告了用胶带粘贴法剥离采集角质层中的蛋白质、角蛋白⁽²²⁾、组织蛋白酶⁽²³⁾、转谷氨酰胺酶⁽²⁴⁾、精氨酸酶⁽²⁵⁾等生化检测。

采用胶带粘贴法检测角质层CML，可以方便采集并直接检测皮肤蛋白中的糖化应激状态⁽²⁶⁾。将市售粘合片，如角质检查 AST-01(ASAHI BIOMED公司制)等，用手指按压在受试者右上臂内侧约 5秒，然后从皮肤上剥离，采集角质层(图４)。将采集有角质层的粘合片切碎后，在Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5)中使用微型匀浆器等匀浆，以便将粘合片表面的粘合剂刮掉，然后回收角质层提取液。使用市售的用ELISA法来检测的试剂盒，来检测角质层提取液中的 CML。同时另行检测角质层蛋白提取液中的蛋白量，计算出每种角质层蛋白的 CML量。

图４　角质层胶带粘贴法
上臂内侧

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糖化应激和抗衰老

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